化學(xué)發(fā)光免疫分析——磁珠性質(zhì)與應(yīng)用

化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）以高靈敏度聞名，可在低濃度下檢測(cè)分析物，在寬動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)提供良好檢測(cè)限。免疫磁珠（Immunomagnetic Bead，IMB）具有操作簡(jiǎn)便、分離效率高、比表面積大及物理穩(wěn)定性良好的優(yōu)點(diǎn)，是一種性能優(yōu)良的磁性分離載體，是純化、檢測(cè)和定量分析復(fù)雜分析物的通用工具。磁珠作為固相載體與CLIA相結(jié)合，在外加磁場(chǎng)的作用下，能夠快速與底物液相分離，磁珠以其高效分離和富集作用在免疫分析反應(yīng)中使抗原對(duì)磁珠上固定化抗體的影響顯著降低。

磁珠作為免疫反應(yīng)和信號(hào)收集載體的優(yōu)勢(shì)：

1）磁珠比表面積大，能結(jié)合更多的蛋白分子，可提高檢測(cè)范圍。
2）磁珠表面化學(xué)基團(tuán)與蛋白形成共價(jià)偶聯(lián)，相對(duì)于物理吸附更牢固，更穩(wěn)定。
3）磁珠均勻懸浮于反應(yīng)溶液中，大大增加與樣本中待測(cè)物接觸面積，減少反應(yīng)所需的樣本量，同時(shí)更快達(dá)到反應(yīng)動(dòng)態(tài)平衡，加快反應(yīng)速度，節(jié)省反應(yīng)時(shí)間。
4）將連有多種捕獲蛋白的磁珠與多標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)同一樣本中多個(gè)待測(cè)物同時(shí)檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)個(gè)體化檢測(cè)。

1.磁珠種類及結(jié)構(gòu)

1.1 常見(jiàn)磁珠種類

1）羧基磁珠（Carboxyl Mag）

Carboxyl羧基磁珠是一種化學(xué)發(fā)光試劑用高性能磁珠，羧基官能團(tuán)用于蛋白或核酸偶聯(lián)，在酶免測(cè)定、免疫沉降、蛋白質(zhì)印記解析時(shí)能夠發(fā)揮突出性能。

2）甲苯磺?；胖椋═osyl Mag）

因磁珠涂層中含有甲苯磺?；?，含有氨基的抗體等分子無(wú)需羧合劑，可直接以化學(xué)結(jié)合的方式固定在磁珠表面

3）鏈霉親和素磁珠（Streptavidin Mag）

磁珠偶聯(lián)鏈霉親和素能對(duì)生物素標(biāo)記的分子進(jìn)行高純度的特異性吸收，且磁珠表面親水性聚合物涂層不會(huì)對(duì)酶促反應(yīng)、PCR核酸擴(kuò)增產(chǎn)生影響。

1.2 結(jié)構(gòu)

磁珠結(jié)構(gòu)一般由磁性內(nèi)核、包裹在外的高分子涂層及功能基層構(gòu)成。在外部磁場(chǎng)作用下，磁珠在磁場(chǎng)中做定向運(yùn)動(dòng)，輔以微控制和檢測(cè)手段，可實(shí)現(xiàn)磁珠定位和介質(zhì)分離。

磁珠結(jié)構(gòu)

Fig 1. 磁珠結(jié)構(gòu)（圖片參照文獻(xiàn)Aptamer-Modified Magnetic Beads in Biosensing）

1）內(nèi)核：主要由純金屬（如鈷、鎳和鐵）或其氧化物等磁性材料組成，此外還可采用CoPt3、FeCo和FePt等磁性材料。

2）高分子涂層：材料一般為聚苯乙烯、聚氯乙烯，主要用于穩(wěn)定新形成的磁珠表面和防止磁珠聚集。高分子涂層可以與多種活性物質(zhì)結(jié)合，如抗原、抗體、核酸等。

3）功能基層
蛋白質(zhì)或抗體偶聯(lián)磁珠表面的穩(wěn)定性主要取決于表面性質(zhì)。當(dāng)磁珠表面無(wú)修飾時(shí)，抗體通過(guò)疏水相互作用被動(dòng)吸附到磁珠表面。這種方式不能控制附著分子的最終方向，也無(wú)法保證捕獲分子的特異性和穩(wěn)定性。為確保偶聯(lián)穩(wěn)定性與捕獲特異性，可選擇化學(xué)修飾表面與生物修飾表面。

化學(xué)修飾表面：

①　經(jīng)典化學(xué)修飾表面：抗原或抗體直接被動(dòng)吸附于化學(xué)修飾磁珠表面?；钚曰鶊F(tuán)利用磁珠的表面積為抗原或抗體提供大量位點(diǎn)，使其與磁珠共價(jià)連接。添加到表面的經(jīng)典基團(tuán)有羧基、氨基、羥基和硫酸鹽。

Table 1. 磁珠經(jīng)典化學(xué)修飾及活化方式

磁珠化學(xué)修飾	活化方式
羧基修飾	添加碳二亞胺（EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）或磺基NHS和乙基（二甲氨基丙基）進(jìn)行活化
氨基修飾	激活蛋白質(zhì)表面羧基
羥基修飾	在非水溶液中活化，以避免中間體水解

②　預(yù)活化修飾表面：分子連接到表面預(yù)活化修飾磁珠之前無(wú)需進(jìn)行初步激活，在適宜緩沖液、pH和溫度條件下即可形成穩(wěn)定共價(jià)偶聯(lián)。

Table 2. 磁珠預(yù)活化修飾及結(jié)合基團(tuán)

磁珠預(yù)活化修飾	結(jié)合基團(tuán)
甲苯磺?；═osyl）修飾	中性pH值：結(jié)合蛋白質(zhì)巰基；偏堿性pH值：結(jié)合氨基。
環(huán)氧基團(tuán)修飾	pH值稍偏堿性：結(jié)合硫醇基團(tuán)；較高pH值：結(jié)合氨基；強(qiáng)堿性pH值：結(jié)合含羥基的配體。
氯甲基修飾	室溫中性pH值：結(jié)合氨基

生物修飾表面（表面生物功能化）：

生物功能化磁珠由于其超順磁性被廣泛用于捕獲特定分子或細(xì)胞。生物修飾與化學(xué)修飾不同，生物修飾以非共價(jià)方式連接分子。在生物技術(shù)領(lǐng)域生物功能化磁珠通常用于蛋白質(zhì)/分子純化等分離過(guò)程，在體外診斷試劑中作為固相載體。

①　蛋白A或G以非常高的親和力結(jié)合某些免疫球蛋白亞型。蛋白A結(jié)合大多數(shù)Ig的Fc區(qū)，蛋白G結(jié)合Ig的Fc或Fab區(qū)，可用于固定抗體；
②　鏈霉親和素具有極高親和力，鏈霉親和素與生物素之間的結(jié)合可承受高溫、大范圍pH值等極端條件。

Table 3. 磁珠功能基層對(duì)比

功能基層	作用方式	優(yōu)點(diǎn)	缺點(diǎn)
無(wú)	磁珠與抗體被動(dòng)偶聯(lián)	便宜	易出現(xiàn)大量非特異性結(jié)合，產(chǎn)生高背景值
化學(xué)修飾	磁珠通過(guò)表面-COOH、-NH2、 -OH、-SH等化學(xué)修飾基團(tuán)與抗體共價(jià)偶聯(lián)	表面修飾簡(jiǎn)單，偶聯(lián)穩(wěn)定	易出現(xiàn)聚合和非特異性結(jié)合
生物修飾	磁珠通過(guò)表面鏈霉親和素、抗IgG、蛋白A或G等生物修飾與抗體非共價(jià)偶聯(lián)	生物磁分離，無(wú)需額外洗滌；可承受高溫等極端條件	價(jià)格昂貴

2.免疫磁珠作用原理及應(yīng)用

2.1 原理

磁珠一般具有超順磁性，在磁場(chǎng)作用下實(shí)現(xiàn)結(jié)合、未結(jié)合蛋白快速分離，簡(jiǎn)化操作，縮短反應(yīng)時(shí)間。磁珠表面通過(guò)外部修飾的功能基團(tuán)結(jié)合活性蛋白，作為抗原抗體反應(yīng)的載體。磁珠作用方式分為直接作用和間接作用兩種，直接作用是用抗體/抗原包被磁珠直接與特異性抗原/抗體物質(zhì)結(jié)合后，形成磁珠-免疫復(fù)合物。間接作用是用二抗包被磁珠，抗原與一抗進(jìn)行孵育，再加入二抗偶聯(lián)的磁珠，形成磁珠-二抗-一抗-抗原復(fù)合物。復(fù)合物具有強(qiáng)磁響應(yīng)性，在磁力的作用下定向移動(dòng)，使復(fù)合物與液體中其他物質(zhì)分離，達(dá)到分離、濃縮、純化特異性蛋白的目的。

磁珠作用原理

Fig 2. 磁珠作用原理

2.2 應(yīng)用

免疫磁珠固相化抗原或抗體在免疫檢測(cè)、細(xì)胞分離、生物大分子純化、分子生物學(xué)等方面得到了廣泛應(yīng)用。免疫磁珠還可用于臨床靶向藥物遞送、磁共振成像和細(xì)胞間熱療靶向破壞腫瘤。

1）免疫檢測(cè)

在免疫檢測(cè)中，免疫磁珠作為固相載體，抗體與抗原在磁珠上特異性結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，在磁力作用下，使特異性抗原與其它物質(zhì)分離。這種次磁性分離具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、特異性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。磁珠還可通過(guò)極性現(xiàn)象來(lái)檢測(cè)表面分子、判斷細(xì)胞類型，可用于激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、腫瘤相關(guān)抗原等物質(zhì)的檢測(cè)。

2）細(xì)胞分離

運(yùn)用磁珠和抗體可在磁場(chǎng)作用下進(jìn)行細(xì)胞分離，廣泛應(yīng)用于：

①　體液中少量腫瘤細(xì)胞檢測(cè)，提高腫瘤早期診斷率；
②　快速高效分離T、B細(xì)胞，用于器官移植中HLA組織分型；
③　骨髓移植物的預(yù)處理，提高移植成功率；
④　各種醫(yī)療、科研項(xiàng)目特定細(xì)胞成分的分離或清除。

3）生物純化

磁珠可作為微型配基載體，在基質(zhì)上固相化抗原或抗體，形成特異性吸附，再進(jìn)行磁性親和抽提，不需離心和過(guò)濾?？捎糜诜蛛x純化大分子、DNA、RNA、DNA結(jié)合蛋白、mRNA等物質(zhì)。

4）分子生物學(xué)應(yīng)用

磁珠借助親和素-生物素系統(tǒng)可與非蛋白質(zhì)結(jié)合，用磁珠固相分離單鏈法，可直接對(duì)PCR雙鏈產(chǎn)物進(jìn)行分離或?qū)ζ鋯捂溸M(jìn)行測(cè)序。

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