電化學(xué)發(fā)光免疫分析機(jī)理及其應(yīng)用
電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是一種集電子發(fā)光技術(shù)、納米微粒子技術(shù)、生物素-親和素系統(tǒng)、抗原-抗體免疫反應(yīng)、電磁場(chǎng)分離整合為一體的自動(dòng)化標(biāo)記免疫分析系統(tǒng)，是電化學(xué)發(fā)光和免疫測(cè)定的結(jié)合。ECLIA常用磁珠微球作為固相載體，三聯(lián)吡啶釕[ Ru（bpy）3]2+作為發(fā)光物質(zhì)，由電極激發(fā)，在三丙胺參與下迅速穩(wěn)定發(fā)光，使檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠，其精密度、準(zhǔn)確度均優(yōu)于酶聯(lián)免疫法。ECLIA既具有發(fā)光檢測(cè)的高度靈敏性， 又具有免疫分析的高度特異性， 整個(gè)反應(yīng)過程在全自動(dòng)化封閉體系中進(jìn)行，無人為操作誤差影響。ECLIA具有無放射性、靈敏度高、線性范圍寬、操作簡單、易標(biāo)記、可實(shí)現(xiàn)在線分析等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注，并且適用于對(duì)生物組織、體液等復(fù)雜生物樣品中極低含量的生化物質(zhì)及藥物分析，因此在免疫分析研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。
ECLIA與其他幾種標(biāo)記技術(shù)相比，具有許多優(yōu)點(diǎn)：
1）無放射性輻射危害，是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；
2）靈敏度高，檢測(cè)線性范圍在6個(gè)數(shù)量級(jí)，下限值為1pmol，達(dá)到或超過放射免疫分析（RIA）水平；
3）檢測(cè)速度快，僅需幾分鐘到十幾分鐘；
4）穩(wěn)定性好，自動(dòng)化程度高，可直接使用液體試劑；
5）應(yīng)用范圍寬，既可檢測(cè)不同分子大小的抗原、半抗原、抗體，又可用于核酸探針檢測(cè)。
1.電化學(xué)發(fā)光原理
電化學(xué)發(fā)光免疫分析包括了電化學(xué)反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過程。二價(jià)的三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）3]2+作為標(biāo)記物，有標(biāo)記物的生物分子與配體發(fā)生特異的結(jié)合反應(yīng)后，進(jìn)入流動(dòng)測(cè)量室，此時(shí)電發(fā)光過程被啟動(dòng)。
1）電化學(xué)反應(yīng)過程：在一定的電壓作用下，[Ru（bpy）3]2+釋放電子成為[Ru（bpy）3]3+，同時(shí)電極表面的三丙胺（TPA）也釋放電子成為陽離子自由基 TPA+，并迅速自發(fā)脫去一個(gè)質(zhì)子而形成三丙胺自由基TPA·；
2）化學(xué)發(fā)光過程：具有強(qiáng)氧化性的三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）3]3+和具有強(qiáng)還原性的三丙胺自由基TPA·發(fā)生氧化還原反應(yīng)，結(jié)果使[Ru（bpy）3]3+還原成激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）3]2+*，然后它以熒光機(jī)制衰變釋放出一個(gè)波長為620nm光子的能量，而成為基態(tài)的[Ru（bpy）3]2+；
3）上述化學(xué)發(fā)光過程后，反應(yīng)體系中仍存在二價(jià)的三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）3]2+和三丙胺（TPA），電極表面的電化學(xué)反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光過程可以循環(huán)進(jìn)行。通過上述的循環(huán)過程，測(cè)定信號(hào)不斷地放大，檢測(cè)靈敏度大大提高，故電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)具有高靈敏的特點(diǎn)；
4）上述的電化學(xué)發(fā)光過程產(chǎn)生光信號(hào)的強(qiáng)度與[Ru（bpy）3]2+的濃度成線性關(guān)系。將[Ru （bpy）3]2+與免疫反應(yīng)體系中的一種物質(zhì)結(jié)合，經(jīng)免疫反應(yīng)、分離后，檢測(cè)免疫反應(yīng)體系中剩余二價(jià)的三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）3]2+經(jīng)上述過程后所發(fā)出的光，即可得知待檢物的濃度。
2.電化學(xué)發(fā)光體系
1）Ru（bpy）3+和Ru（bpy）33+的湮滅ECL
通過階越脈沖電位法改變電極電位產(chǎn)生氧化態(tài)Ru（bpy）33+和還原態(tài)Ru（bpy）3+，這兩種物質(zhì)經(jīng)過擴(kuò)散相互接觸之后，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)Ru（bpy）32+*，Ru（bpy）32+*衰減回落至基態(tài)產(chǎn)生ECL。整個(gè)過程遵循單重態(tài)電化學(xué)發(fā)光路徑（S-route）。
Fig.1 湮滅ECL反應(yīng)過程
2）還原氧化型ECL
當(dāng)電極施加一個(gè)合適的還原電位時(shí)，Ru（bpy）32+被還原成Ru（bpy）3+，同時(shí)另一共反應(yīng)物如過硫酸根離子（S2O82-）被還原形成具有強(qiáng)氧化能力的中間體，該中間體可將Ru（bpy）3+氧化產(chǎn)生激發(fā)態(tài)Ru（bpy）32+*，引發(fā)ECL。
Fig.2 還原氧化型ECL反應(yīng)過程
早期對(duì)氧化還原型電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的研究僅限于有機(jī)相，因?yàn)樵谳^低還原電位的作用下，常用金屬電極在水溶液中的析氫現(xiàn)象嚴(yán)重制約了Ru（bpy）32+-SO4-體系，拓展了水溶液中還原氧化型電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的應(yīng)用與研究。
3）氧化還原型ECL
與還原氧化反應(yīng)相反，當(dāng)在電極上施加一個(gè)合適的氧化電位時(shí)，Ru（bpy）32+在電極表面被氧化產(chǎn)生Ru（bpy）33+，它可和溶液中的其他還原劑反應(yīng)得到激發(fā)態(tài)Ru（bpy）32+*，從而產(chǎn)生ECL。目前研究較充分且應(yīng)用廣泛的還原劑是三丙胺（TPrA），它與三聯(lián)吡啶釕氧化還原電化學(xué)發(fā)光的機(jī)理主要有以下三種：
① Ru（bpy）32+在電極表面被氧化形成Ru（bpy）33+，而TPrA在電極表面被氧化生成TPrA+·，它脫去質(zhì)子形成強(qiáng)還原性的TPrA·后，TPrA·可將Ru（bpy）33+還原得到激發(fā)態(tài)Ru（bpy）32+*，產(chǎn)生ECL。
② 具有強(qiáng)還原性的TPrA·不僅可以還原Ru（bpy）33+，同時(shí)還可還原溶液中Ru（bpy）32+產(chǎn)生Ru（bpy）3+，而Ru（bpy）3+又可以和Ru（bpy）33+通過湮滅機(jī)理產(chǎn)生ECL
③ 當(dāng)TPrA濃度遠(yuǎn)大于Ru（bpy）32+時(shí)（約104-105倍過量），僅在0.9V的氧化電位下就可觀察到ECL。TPrA在電極上失去一個(gè)電子形成具有一定氧化能力的TPrA+，TPrA+一方面可轉(zhuǎn)變?yōu)門PrA·并與Ru（bpy）32+反應(yīng)生成Ru（bpy）3+；另一方面TPrA+又可充當(dāng)氧化劑，把生成的Ru（bpy）3+氧化為激發(fā)態(tài)的Ru（bpy）32+*從而產(chǎn)生ECL。
Fig.3 還原氧化型ECL的三種反應(yīng)過程
4）溶解氧陰極電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理
基于水溶液中氧氣還原的陰極電化學(xué)發(fā)光機(jī)理是與以上介紹的湮滅電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理、還原氧化型和氧化還原型電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理完全不同的，因?yàn)殛帢O電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)并不涉及Ru（bpy）32+在電極上的直接氧化，而電極反應(yīng)主要是水溶液中氧氣的還原，還原產(chǎn)物為強(qiáng)氧化性物質(zhì)，這些物質(zhì)可使溶液中Ru（bpy）32+氧化變?yōu)镽u（bpy）33+，并且最終通過湮滅反應(yīng)形成激發(fā)態(tài)Ru（bpy）32+*，產(chǎn)生ECL信號(hào)。
3.ECLIA在醫(yī)學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用
1）傳染疾病病原體診斷
目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用ELISA和膠體金法對(duì)病原體進(jìn)行檢測(cè)，但對(duì)于低濃度樣本，檢測(cè)時(shí)常因方法學(xué)的原因造成靈敏度低，導(dǎo)致臨床出現(xiàn)漏檢，并且由于影響檢測(cè)的因素較多，尤其是灰區(qū)附近的樣本測(cè)定結(jié)果差異大，導(dǎo)致重復(fù)性差。膠體金雖然操作簡單，但靈敏度較低，臨床漏檢率相對(duì)較高。以艾滋病（HIV）檢測(cè)為例，國內(nèi)HIV感染的臨床診斷以血清病毒抗體檢測(cè)為主，運(yùn)用ECLIA測(cè)定血清HIV的整個(gè)檢測(cè)過程中是在封閉流動(dòng)系統(tǒng)中進(jìn)行，極大地降低了交叉污染，測(cè)定結(jié)果不僅快速、準(zhǔn)確、可靠，完成單個(gè)樣品分析時(shí)間也大大縮短，且特異性、精密度均優(yōu)于ELISA并克服了鉤狀效應(yīng)等假陰性現(xiàn)象，可批量上機(jī)進(jìn)行自動(dòng)化分析。
2）蛋白質(zhì)和激素檢測(cè)
目前激素的檢測(cè)多為RIA與ELISA，前者會(huì)造成生物損害及環(huán)境污染，后者的反應(yīng)底物具有毒性且檢測(cè)結(jié)果受溫度和pH值的影響較大。用ECLIA替代RIA與ELISA可在避免上述危害的同時(shí)給臨床診斷、治療和預(yù)后提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。ECLIA可對(duì)甲狀腺激素、性激素等多種激素進(jìn)行測(cè)定，以糖尿病中的胰島素為例，ECLIA可動(dòng)態(tài)檢測(cè)低濃度范圍的胰島素水平，相較于其他方法來說ECLIA是一種非常靈敏可信且沒有放射污染的均質(zhì)分析方法。
ECLIA測(cè)定血清肌酸激酶、肌鈣蛋白、肌紅蛋白和地高辛等，有利于診斷早期心肌梗死等心肌損傷性疾?。粰z測(cè)黃體生成素、促卵泡生成素、雌二醇、孕酮、催乳素、睪酮等，可利于診斷早期生殖系統(tǒng)疾??；檢測(cè)胰島素、胰島素樣生長因子，有利于糖尿病早期診斷；還可用于血清T3、T4、FT3、FT4等甲狀腺激素的測(cè)定。
3）腫瘤診斷
隨著腫瘤基礎(chǔ)理論的發(fā)展，新檢測(cè)手段和技術(shù)大量涌現(xiàn)。腫瘤標(biāo)志物在腫瘤診治中的重要作用已被學(xué)術(shù)界所公認(rèn)，目前主要用于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)，如前列腺特異性抗原（PSA）、甲胎蛋白（AFP）能用于普查無癥狀的腫瘤病人、腫瘤的鑒別診斷與分期、預(yù)后判斷、療效觀測(cè)與判別復(fù)發(fā)的指標(biāo)。ECLIA因其出色的靈敏度與無放射性污染在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中逐步取代其它檢測(cè)方法。
ECLIA可對(duì)良性及惡性腫瘤患者進(jìn)行體外早期輔助診斷，可以免除腫瘤介入檢查的高費(fèi)用，同時(shí)還可針對(duì)檢測(cè)血中的癌胚抗原和腫瘤相關(guān)糖蛋白抗原進(jìn)行結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌等消化系統(tǒng)及卵巢癌、子宮頸癌、乳腺癌等婦科癌癥的診斷。此外ECLIA還可檢測(cè)血清HCG，適用于早孕和宮外孕診斷。
4）檢測(cè)細(xì)胞因子及基因
體內(nèi)細(xì)胞因子種類繁多，但含量均較少，常規(guī)檢測(cè)方法難以得到準(zhǔn)確結(jié)果，運(yùn)用ECLIA可以很好的解決這一不足。ECLIA可用于測(cè)定腦內(nèi)衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)營養(yǎng)因子（TNF），也可用于測(cè)定T細(xì)胞中γ-干擾素水平及血清、細(xì)胞培養(yǎng)液中多種白細(xì)胞介素的含量。
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蘇公網(wǎng)安備32011202001302