免疫比濁平臺

免疫比濁法（Turbidimetric inhibition immunoassay）也被稱作免疫濁度法，是一種將現(xiàn)代光學(xué)測量儀器、自動(dòng)分析檢測系統(tǒng)與抗原抗體免疫沉淀反應(yīng)相結(jié)合的技術(shù)。當(dāng)溶液中的抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物，免疫復(fù)合物會從液相析出使溶液產(chǎn)生一定的濁度，當(dāng)有光線通過溶液時(shí)，光線在碰到抗原抗體復(fù)合物后就會產(chǎn)生折射或吸收，測定這種折射和吸收后的透射光或散射光，即可得到溶液的濁度，進(jìn)而計(jì)算出樣品的含量。

利用免疫比濁平臺能夠準(zhǔn)確的對液體介質(zhì)中的微量抗原、抗體、藥物及其他小分子半抗原物質(zhì)進(jìn)行測定，在臨床上具有廣泛的應(yīng)用。

免疫比濁原理

當(dāng)抗原與抗體在特殊稀釋系統(tǒng)中反應(yīng)而且比例合適(一般規(guī)定抗體過量)時(shí)，形成小分子可溶性免疫復(fù)合物，形成的可溶性免疫復(fù)合物在稀釋系統(tǒng)中的促聚劑(聚乙二醇等)的作用下，自液相析出，形成微粒，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度，當(dāng)反應(yīng)液中保持抗體過剩時(shí)，形成的復(fù)合物隨抗原量增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增加，反應(yīng)液濁度與抗原含量呈正相關(guān)。當(dāng)光線通過反應(yīng)液時(shí)遇到這些微粒后會形成折射或吸收，對透射光或折射光強(qiáng)度進(jìn)行測定即可得到反應(yīng)液濁度。用一系列已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行試驗(yàn)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出標(biāo)本中抗原含量。

免疫比濁技術(shù)原理

圖1：免疫比濁原理

抗原抗體復(fù)合物形成與光濁度的關(guān)系

抗原抗體的比例是濁度形成的關(guān)鍵因素，反應(yīng)物抗原與抗體的比例決定了復(fù)合物顆粒的大小?？乖?抗體復(fù)合物形成可以分為三步：

1. 初步形成抗原-抗體二元復(fù)合物
2. 復(fù)合物交聯(lián)成大的網(wǎng)絡(luò)狀復(fù)合物；
3. 復(fù)合物產(chǎn)生絮狀沉淀。

抗原抗體在等價(jià)時(shí)，抗原和抗體全部結(jié)合，即無過剩的抗原，也無過剩的抗體，這時(shí)復(fù)合物的形成和解離相等；當(dāng)反應(yīng)液中抗體過量時(shí)，復(fù)合物隨著抗原量遞增至而增加，至抗原抗體量相當(dāng)時(shí)反應(yīng)液濁度達(dá)到最高點(diǎn)；當(dāng)抗原過量時(shí)，復(fù)合物小，光散射少。所以在比濁法中必須在反應(yīng)液中抗體過量時(shí)進(jìn)行。

發(fā)展歷程

在1938年，Libby將光濁度測定原理用到了抗原抗體反應(yīng)上，并對這種新的檢測方法進(jìn)行了摸索。但當(dāng)時(shí)由于蛋白質(zhì)純化技術(shù)不完善，特異性血清制備有困難，因此阻礙了技術(shù)的發(fā)展。他在這方面的研究雖然沒有得到滿意的結(jié)果，但卻成功地吸引了許多學(xué)者的目光。

20世紀(jì)50年代末60年代初，Schultze和Schwick提出若干種血漿蛋白與其特異抗體結(jié)合后形成的抗原抗體復(fù)合物可以引起液體濁度改變，并可以用比濁計(jì)來進(jìn)行測定，成功地提出了“透射比濁法”。但遺憾的是，這種方法當(dāng)時(shí)因其靈敏度低而沒有被廣泛接受。

1967年，Ritchie提出了用激光散射法來測定抗原抗體復(fù)合物，這中方式被稱之為“散射比濁法”。這使得常規(guī)的凝膠內(nèi)擴(kuò)散沉淀法由數(shù)十小時(shí)縮短為數(shù)十分鐘。從此，免疫比濁技術(shù)開始了快速發(fā)展。同時(shí)，飛速發(fā)展的單克隆抗體技術(shù)也對免疫比濁法起到了極大的促進(jìn)作用。20世紀(jì)70年代初，出現(xiàn)了利用濁度進(jìn)行的自動(dòng)檢測系統(tǒng)，但由于用激光作為光源，且固定波長，所以靈敏度較低，而且時(shí)間一般要2～3h。到20世紀(jì)70年代末，出現(xiàn)了速率比濁計(jì)，使抗原抗體結(jié)合的反應(yīng)在幾十秒內(nèi)出結(jié)果，這帶來了免疫化學(xué)測定的革命性的發(fā)展。

如今，自動(dòng)化免疫分析系統(tǒng)更加飛速發(fā)展，已經(jīng)成為了免疫診斷技術(shù)中最重要的檢測手段之一。它使得臨床化學(xué)檢驗(yàn)方法的靈敏度更高、特異性更強(qiáng)，自動(dòng)化程度更高。尤其為疾病的診斷、療效觀察及病因探討提供了更直接和客觀的資料。

免疫比濁分類

按測定方法分類

按照測定方法的不同可以將免疫比濁分為終點(diǎn)濁度測定法和速率濁度測定法，前者是測定抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)完成后測定其復(fù)合物的量，后者是在抗原與抗體反應(yīng)的最高峰（約1分鐘）測定其復(fù)合物形成的量。

按照檢測儀器分類

當(dāng)光線遇到免疫復(fù)合物時(shí)會發(fā)生透射或散射，對透射光或散射光進(jìn)行檢測均可測得反應(yīng)液濁度，因此可以按照檢測儀器將免疫比濁分為免疫透射比濁法和免疫散射比濁法。

免疫透射比濁法：入射光線與光度接收器在同一水平面上的檢測方法，目前臨床應(yīng)用較多的是免疫透射比濁技術(shù)。

免疫散射比濁法：入射光線與光度接收器不在同一水平面上的檢測方法（光度接收器與水平面形成0°到90°的夾角）

按照有無增強(qiáng)作用分類

按照有無增強(qiáng)作用可以將比濁分為普通免疫比濁和膠乳增強(qiáng)免疫比濁。

普通免疫比濁：值抗原抗體直接反應(yīng)產(chǎn)生濁度進(jìn)行分析的方法。

膠乳增強(qiáng)免疫比濁：即指羧基化聚苯乙烯微球通過EDC偶聯(lián)上抗體，再于抗原反應(yīng)，起到信號放大作用的方法。

免疫比濁試劑盒

免疫比濁平臺由檢測儀器及免疫比濁試劑盒兩部分組成，下面就免疫比濁試劑盒做一介紹。免疫比濁試劑盒一般包含3部分：

檢測試劑：又分為試劑R1和試劑R2，試劑R1主要是緩沖鹽體系，提供抗原抗體比較適宜的反應(yīng)條件；試劑R2主要成分就是抗體（膠乳比濁試劑盒R2試劑為偶聯(lián)上抗體的羧基化聚苯乙烯膠乳微球），R2試劑制備是免疫比濁試劑盒的核心技術(shù)。

校準(zhǔn)品：為檢測試劑在生化儀上制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的定制和抗原樣品。

質(zhì)控品：為檢測試劑在生化儀上的重復(fù)性，穩(wěn)定性的定值抗原樣品。

免疫比濁試劑盒評價(jià)

免疫比濁試劑盒評價(jià)主要包括以下內(nèi)容：

精密度：包括批內(nèi)精密度和批間精密度；

線性范圍：評價(jià)試劑在一定范圍內(nèi)的線性程度；

準(zhǔn)確度：評價(jià)試劑與其他廠家是否具有可比性；

抗干擾能力：評價(jià)試劑在一定干擾物質(zhì)存在的條件下，測試值與理論值的差距是否在合理范圍內(nèi)；

穩(wěn)定性：包括上機(jī)開瓶穩(wěn)定性，實(shí)時(shí)儲存穩(wěn)定性及運(yùn)輸穩(wěn)定性；

臨床應(yīng)用

免疫功能監(jiān)測：免疫球蛋白A、免疫球蛋白C、免疫球蛋白M、免疫球蛋白輕鏈k，免疫球蛋白輕鏈λ、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4等。

心血管疾病檢測：載脂蛋白A1、載脂蛋白B、脂蛋白α等

炎癥狀況檢測：C-反應(yīng)蛋白、血清淀粉樣蛋白A、降鈣素原、銅藍(lán)蛋白等。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎檢測：類風(fēng)濕因子、C-反應(yīng)蛋白、抗鏈球菌溶血素O等。

腎臟功能監(jiān)測：尿微量白蛋白、α1微球蛋白、β2微球、轉(zhuǎn)鐵蛋白、免疫球蛋白G等。

營養(yǎng)狀態(tài)監(jiān)測：白蛋白、前白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等。

新生兒體檢：C反應(yīng)蛋白、免疫球蛋白A、前白蛋白、免疫球蛋白G等

凝血及出血性疾病的檢測：抗凝血酶Ⅲ、觸珠蛋白等

藥物濃度檢測：丁胺卡那霉素、卡馬西平、慶大霉素、苯巴比妥、苯妥因奎尼丁、妥布素等。