促甲狀腺素受體抗體（TRAb）的檢測方法

促甲狀腺素受體抗體（TRAb）是Graves?。℅D）的特異性生物標(biāo)記物，對于GD的診斷、判斷病情活動、評價停藥時機(jī)、預(yù)測復(fù)發(fā)等方面具有重要的臨床意義。目前促甲狀腺受體（TSHR）抗體的檢測方法主要有受體分析法和生物分析法兩大類。相比于生物分析法，受體分析法操作更簡單，技術(shù)要求低，檢測時間短，更適用于臨床檢測。生物分析法則能區(qū)分甲狀腺刺激抗體（TSAb）和甲狀腺刺激阻斷性抗體（TSBAb），具有一定的臨床研究意義。

1. 促甲狀腺受體抗體（TRAb）的受體分析法

受體分析法設(shè)計原理是基于TSHR抗體（即TRAb）能與促甲狀腺激素受體（TSHR）發(fā)生特異性結(jié)合。常見的受體分析法有放射免疫法（RRA）、酶聯(lián)免疫法、免疫熒光法和化學(xué)發(fā)光法（ECLIA）。其中ECLIA檢測速度快、易操作且無放射污染，已實現(xiàn)了全自動化，適合廣泛應(yīng)用于臨床。受體分析法的局限性在于僅能檢測TRAb總和，無法區(qū)分TSAb和TSBAb。

1.1 放射受體分析法（RRA）

RRA分競爭性和非競爭性結(jié)合分析方法兩類。競爭法是利用TSHR抗體能與¹²⁵I-TSH競爭性結(jié)合到TSHR的原理，當(dāng)¹²⁵I-TSH的量固定不變時，¹²⁵I-TSH與TRAb競爭性地和一定量的TSHR發(fā)生可逆的特異性結(jié)合，隨著樣本中TRAb量的增加，¹²⁵I-TSH-TSHR復(fù)合物的量減少。經(jīng)PEG沉淀離心得到¹²⁵I-TSH-TSHR復(fù)合物，通過¹²⁵I放射強度評價TRAb對125I-TSH與促甲狀腺激素受體（TSHR）結(jié)合的抑制效率。非競爭法是利用TSHR抗體的Fab片段與TSHR結(jié)合，F(xiàn)c片段能與¹²⁵I標(biāo)記的葡萄球菌A蛋白結(jié)合形成放射性三聯(lián)復(fù)合物，TRAb的量與三聯(lián)復(fù)合物的量呈正相關(guān)，用TRAb活性指數(shù)來表示其結(jié)果。

RRA法的關(guān)鍵在于制備高活性的可溶性TSHR，可溶性TSHR可以避免正常IgG及未提取血清的非特異性干擾。但RRA一般使用PEG對抗原/同位素標(biāo)記物的復(fù)合物進(jìn)行沉淀、離心，在沒有TRAb的情況下，PEG可以把少量未與TSHR結(jié)合的¹²⁵I-TSH沉淀下來，造成本底信號高，檢測靈敏度降低，無法檢測出TRAb水平較低的患者。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附法 ( ELISA)

非競爭法ELISA是通過血清中TSHR抗體與固相載體表面固定的TSHR結(jié)合后，再與酶標(biāo)記的抗人免疫球蛋白（二抗）結(jié)合，加入酶反應(yīng)底物后，催化產(chǎn)生有色產(chǎn)物，有色產(chǎn)物的量與檢測的TRAb量呈正相關(guān)，將患者樣本與正常樣本作對比，根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行定量分析。競爭法是利用TRAb可抑制酶標(biāo)記的TRAb與固相載體表面固定的TSHR結(jié)合，加入酶反應(yīng)底物后，催化產(chǎn)生有色產(chǎn)物，有色產(chǎn)物量與TRAb的量呈負(fù)相關(guān)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)

通過血清中的TRAb與表達(dá)人TSHR的細(xì)胞結(jié)合后，再與熒光素標(biāo)記的抗人IgG（二抗）結(jié)合，用流式細(xì)胞儀來檢測，陽性細(xì)胞結(jié)合的百分?jǐn)?shù)。以不加血清的樣本為陰性對照，分別測定正常樣本和病人樣本對TSHR的結(jié)合。結(jié)果以正常人陽性細(xì)胞結(jié)合百分?jǐn)?shù)的x±2s為正常范圍。

1.4 直接結(jié)合分析法

采用人工合成TSHR外功能區(qū)（TSHR-289）多肽片段（抗原）和生物素酰基化該抗原的單克隆抗體。利用TSHR抗體可抑制TSHR與生物素酰基化單克隆抗體的結(jié)合，TSHR-289片段與TRAb直接結(jié)合，比色法檢測其光密度（OD）值，以正常人IgG結(jié)合后的OD±2S為正常范圍。直接結(jié)合分析法無需提取TSHR，避免使用不同種屬的TSHR引起所檢TRAb活性不同，但該方法不適用于大量樣本的檢測。

1.5 化學(xué)發(fā)光法（ECLIA）

競爭法一般是利用TSHR抗體可抑制釕復(fù)合物/堿性磷酸酶/吖啶酯標(biāo)記的TSHR抗體與TSHR-生物素-鏈霉親和素-磁珠復(fù)合物結(jié)合，化學(xué)發(fā)光的信號強度與TRAb濃度呈負(fù)相關(guān)。非競爭法一般是通過血清中TRAb與TSHR-生物素-鏈霉親和素-磁珠復(fù)合物結(jié)合，再與吖啶酯/堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG（二抗）結(jié)合，化學(xué)發(fā)光的信號強度與TRAb濃度呈正相關(guān)。

2. 促甲狀腺受體抗體（TRAb）的生物分析法

生物分析方法是根據(jù)不同類型的TSHR抗體與細(xì)胞表面的TSHR結(jié)合，能引起不同生物學(xué)效應(yīng)，來區(qū)分TSAb和TSBAb。TSAb與TSHR結(jié)合后，刺激細(xì)胞，能引起細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高；而TSBAb與TSHR結(jié)合后，阻斷外源性TSH與TSHR結(jié)合，能引起細(xì)胞內(nèi)cAMP水平下降。與受體分析法相比，生物分析方法操作繁瑣，技術(shù)要求較高，檢測時間長，成本偏高等。但從生物分析方法對TRAb的區(qū)分能力看，這類檢測方法更具臨床意義, 值得進(jìn)一步研究。

2.1 cAMP生物分析法

cAMP生物法通常是用聚乙二醇（PEG）粗提法，提取待測血清中的IgG，用以刺激處于生長對數(shù)期的中國倉鼠卵巢細(xì)胞 ( CHO) -TSHR細(xì)胞系，最后使用放射免疫分析或酶聯(lián)免疫法測定cAMP濃度。TSAb活性以待測樣本中細(xì)胞系產(chǎn)生的cAMP相對于正常對照的百分?jǐn)?shù)表示，TSBAb活性以待測樣本對一定濃度的外源TSH誘導(dǎo)產(chǎn)生cAMP的抑制率表示。cAMP生物法存在較大的細(xì)胞組間差異，細(xì)胞培養(yǎng)條件高，限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。

計算公式：TSAb活性=A/B×100%；

TSBAb活性=[ 1-( C-A) /( D-B) ] ×100%；

其中A：待測組（不含外源bTSH）產(chǎn)生的cAMP，B：正常對照組 (不含外源bTSH)產(chǎn)生的cAMP，C：待測組（含外源bTSH）產(chǎn)生的 cAMP，D：正常對照組（含外源bTSH）產(chǎn)生的cAMP。

2.2 化學(xué)發(fā)光生物法

化學(xué)發(fā)光生物法是將帶有cAMP反應(yīng)元件（CRE）和編碼螢火蟲熒光素酶報告基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到表達(dá)人TSHR的中國倉鼠卵（CHO）細(xì)胞中，當(dāng)TSAb作用于TSHR時，激活cAMP途徑，CRE和其下游的熒光素酶基因表達(dá)，產(chǎn)生熒光；而TSBAb不能激活cAMP途徑產(chǎn)生熒光，以此區(qū)分TSAb與TSBAb。

2.3 TSHR-LH/CGR嵌合體 -cAMP法

TSHR胞外區(qū)相應(yīng)序列的殘基被促黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體（LH/CGR）部分殘基取代，構(gòu)建出僅有TSAb表位或僅有TSBAb表位的嵌合體細(xì)胞，通過測定細(xì)胞受血清IgG刺激后cAMP表達(dá)水平，來區(qū)分TSAb與TSBAb。

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